细胞凋亡检测是一种在生物医学研究中至关重要的技术，广泛应用于疾病机制探索和药物筛选等多个领域。本文将详细介绍如何使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会转移到细胞膜外侧，暴露在细胞外环境中，同时细胞膜的通透性会增加。这使得PS特异性结合的Annexin-V探针能够对其进行标记。Annexin-V是一种依赖于钙离子的磷脂结合蛋白，对PS具有很强的结合能力。而PI则是一种经济且稳定的核酸染料，它不会穿透正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但会穿透晚期凋亡或坏死细胞的细胞膜，使细胞核染成红色。当将AnnexinV与PI联用时，活细胞和早期凋亡细胞不会被PI标记，而晚期凋亡细胞和坏死细胞则会同时被FITC和PI标记，从而呈现双阳性结果。

实验材料准备

进行细胞凋亡检测所需材料包括：AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）、离心机、PBS以及荧光显微镜或流式细胞仪。

实验方法

1. 细胞收集

- 悬浮细胞：以1000g离心5分钟，弃去上清液。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次以1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。 - 贴壁细胞：小心吸取细胞培养液，加入PBS洗涤。然后加入适量胰酶消化液（建议不含EDTA，以免影响AnnexinV与PS结合）以消化细胞。加入之前收集的培养液，轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，随后以1000g离心5分钟，弃去上清。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，最终以1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

2. 重悬细胞

将细胞重悬于195μL Binding Buffer中，以达到适宜的浓度。

3. 添加染料

① 向细胞中加入5μL AnnexinV-FITC并轻轻混匀，用于检测早期凋亡细胞（PS外翻）。
② 加入10μL PI Stain并轻轻混匀，用于检测晚期凋亡或坏死细胞（DNA染色）。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，以便染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置适合的通道以检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号。
2. 设置三组对照非常重要，以帮助校正背景信号并确定凋亡细胞比例：
- 未染色组：用于检测自然荧光。
- PI单染组：用于确定PI的阳性阈值。
- AnnexinV-FITC单染组：用于确定AnnexinV的阳性阈值。

荧光显微镜检测

1. 离心后用少量Binding Buffer重悬细胞并制成涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，通常AnnexinV-FITC会发出绿色荧光，PI发出红色荧光。
3. 可以通过拍照或计数来定量分析凋亡细胞的比例。

注意事项

1. 整个操作过程中应尽量保持低温，以降低细胞代谢和染色过程中的自发荧光。
2. 避免长时间暴露于光照下，特别是FITC类染料，因为光照可能导致荧光的淬灭。
3. 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
4. 若使用流式细胞仪，确保仪器已校准并且通道设置正确。
在细胞凋亡研究中，选择高品质的试剂盒，如尊龙凯时提供的细胞凋亡检测试剂盒，可以显著提高实验的可靠性和准确性，助力您的生物医学研究。