在之前发布的文章中，我们已了解到慢病毒能够高效地将外源基因整合到宿主染色体上，从而在体内实现长期表达。这种病毒具有感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞的能力，因而成为一种强大而有效的基因传递工具，广泛应用于生物医疗研究中。接下来，我们将分享在获取包装好的慢病毒后，应该如何进行下一步操作的详细步骤。

1. 病毒的储存

包装完成的慢病毒建议分装后储存在-80℃冰箱中，储存期限为六个月。若超过该时间，使用前需重新测定病毒滴度。如果短时间内（3-5天）进行实验，也可以选择将其保存于4℃。在使用过程中，应尽量避免反复冻融，以防降低病毒滴度，可根据实验用量进行分装。

2. 病毒的稀释

如需稀释病毒，请先将其在冰中融化后，用PBS或不含血清的培养基稀释混匀，再于4℃保存。为保证病毒滴度，建议在三天内使用完毕。

3. 预实验摸索最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性各异，且不同慢病毒载体的荧光强度也有所不同。因此，在正式实验前需通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数（Multiplicty of Infection，MOI）以及最佳的感染条件。这包括接种的细胞量、感染时总体积和换液时间，以确保后续实验效果最佳。

感染预实验步骤

第1天：将生长状态良好的目的细胞接种于96孔板中，数量为1×10⁴个/孔，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养过夜。接种细胞的数量应以第2天细胞密度约30-50%为宜。
第2天：根据实验需求或文献中的MOI值设置梯度范围，通常为3-100。取出病毒并冰浴融化，假设病毒滴度为1×10⁸ TU/mL，按照设定的MOI计算所需加入的病毒原液量。
第3天：更换培养液，通常在病毒感染16-24小时后，将含有慢病毒的培养液更换为正常培养液，继续培养。
第4-5天：使用倒置荧光显微镜观察感染48-72小时后的细胞荧光及拍照，以确认慢病毒感染的效率，从而确定合适的MOI值用于正式实验。

4. 正式感染实验

在确定了对靶细胞的亲嗜性及合适的MOI值后，可以进行正式感染实验。以24孔板中包含GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染为例，操作步骤如下：

1. 第一天：按照实验需要在24孔板中铺板，密度为5-10×10⁴个细胞/孔，确保细胞在第二天达到约50%密度，37℃培养过夜。
2. 第二天：取出病毒进行冰浴融化，按照预实验结果调整病毒浓度，轻轻混匀避免使用振荡器。
3. 吸走原有培养基，将稀释的病毒液加入细胞中，如果需要添加Polybrene，则与病毒原液一同加入，并轻轻摇匀，37℃培养过夜。
4. 感染16-24小时后，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜培养基。
5. 继续培养48-72小时，收集细胞以检测目的蛋白表达。

5. 目的细胞稳转株的构建

成功感染细胞后，通过含有不同抗性的慢病毒筛选出稳定表达目的基因的细胞株。例如，经过48-72小时的感染，细胞应被继续培养在含适当浓度Puromycin的环境中，每3-4天更换一次。这样的抗性筛选能够有效剔除未感染的细胞，最终筛选出稳定的转基因细胞株。

多克隆及单克隆稳转株的构建及保存

尊龙凯时建议在筛选过程中将抗生素浓度降低至维持浓度，以继续选择感染后的细胞。同时收集样本进行qPCR或Western Blot鉴定目的基因的表达水平，并将合格细胞冻存以作保存。需要强调的是，在进行单克隆筛选时，最好通过空细胞进行预实验，确保单个细胞能正常增殖分裂。

通过这些步骤，我们能够高效地使用慢病毒构建细胞株，为后续的生物医疗研究提供坚实的基础。记得在操作中始终关注实验细节，以确保最佳的实验效果和数据可靠性。